D-半乳糖(D-gal)是目前公认的致衰剂，常用于衰老动物模型与细胞衰老体外模型构建。课题组前期研究发现，D-gal复制的衰老动物模型可致动物脑、脾脏、肝脏、胸腺和肾等器官出现结构损伤和功能衰退。胰腺是机体重要的消化腺，兼有内分泌与外分泌双重功能，在维持机体糖代谢和营养物质消化吸收等方面发挥重要作用。本实验采用D-gal建立衰老小鼠模型，通过观察胰腺形态学及其相关功能变化，探讨D-gal对胰腺的作用与相关机制。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物

SPF级2月龄雄性C57BL/6J小鼠，体质量19～21g(重庆市医学实验动物中心，合格证号:SCXK渝2007-0001)。饲养条件控制在20～25℃，自然照明，自由饮水和摄食。

1.1.2主要试剂

D-gal(上海生物工程有限公司，纯度≥99%);OnetouchUItra(强生中国医疗器械有限公司);小鼠晚期糖基化终产物(advancedglycationendproducts，AGEs)检测试剂盒(Abcam有限公司);BCA蛋白浓度测定试剂盒、超氧化物歧化酶(superoxidedismutase，SOD)试剂盒、总抗氧化能力(totalantioxidantcapacity，T-AOC)试剂盒和丙二醛(malonaldehyde，MDA)试剂盒、衰老相关β-半乳糖苷酶(senescence-associatedβ-galactosidase，SA-β-gal)试剂盒(均来自碧云天生物技术研究所);DAB显色液(北京中杉金桥生物技术有限公司)。

1.2方法

1.2.1小鼠衰老模型建立

小鼠随机分为两组，每组10只。对照组:皮下注射0.9%氯化钠溶液，qd×42d;D-gal组:皮下注射D-gal(120mg/kg)，qd×42d。建模期间动态观察小鼠毛色、精神状态、进食量、反应和活动能力等变化。建模完成后第2天采集标本进行相关指标检测。

1.2.2空腹血糖(fastingbloodglucose，FBG)与空腹胰岛素(fastinginsulin，FINS)测定

建模完成后第2天，小鼠禁食过夜(自由饮水)12h，次日清晨取尾静脉血，血糖仪检测FBG水平，以mmol/L表示，血液生化分析测定FINS，以μIU/mL表示。

1.2.3胰腺脏器指数测定与形态学观察

建模完成后第2天，称小鼠体质量(g)后颈椎脱臼处死，分离胰腺称湿重(mg)，计算胰腺脏器指数(胰腺湿重/体质量)。4%多聚甲醛固定胰腺24h，制备石蜡切片，HE染色观察胰腺组织结构，图像分析系统(ImageProPlus6.0)分析测量胰岛内单个有核细胞所占面积。2.5%戊二醛固定胰腺4h，PBS洗3次，1%四氧化锇酸后固定1h，乙醇梯度脱水，环氧树脂Epon812包埋，制备超薄切片，醋酸双氧铀与硝酸铅电子双染色，H-600型透射电镜观察胰腺实质细胞超微结构。

1.2.4SA-β-gal染色检测胰腺细胞衰老

制备胰腺冷冻组织切片，按SA-β-gal试剂盒说明书操作。切片置37℃培养箱中孵育12～16h。光镜下观察着蓝色的阳性细胞，分析胰岛内阳性细胞的相对吸光度(ＲA)值。

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