一、目的要求

1、人工合成色素的测定原理及方法。

2、理解和熟悉高效液相色谱仪的工作原理及操作要点。

3、掌握高效液相色谱技术测定人工合成色素的方法。

二、实验原理

食品中人工合成色素用聚酰胺吸附法或用液-液分配法提取，制成水溶液，注入高效液相色谱仪，经反相色谱分离，根据保留时间和峰面积进行定性和定量。

三、实验仪器与试剂

1、试剂

①甲醇：分析纯，经滤膜(FH 0.5μm)过滤。

②乙酸铵溶液：0.02mol/L。称取1.54g乙酸铵，加水至1000mL，溶解，经滤膜(HA 0.45μm)过滤。

③氨水(2+98)的0.02mol/L乙酸铵溶液：量取氨水(2+98)O.5mL，加0.02mol/L乙酸铵溶液至1000mL。

④聚酰胺粉：过200目。

⑤甲醇一甲酸溶液：6:4。量取甲醇60mL，甲酸40mL，混匀。

⑥柠檬酸溶液：200g/L。称取20g柠檬酸，加水至100mL，振摇溶解。

⑦乙醇-氨水-水溶液：7:2:1。取无水乙醇70mL，氨水20mL，水10mL混匀。

⑧三正辛胺-正丁醇溶液：5:95。量取三正辛胺5mL，加正丁醇95mL，混匀。

⑨饱和硫酸钠溶液。

⑩硫酸钠溶液：20g/L。称取20g硫酸钠，溶解于1000mL蒸馏水中，振摇溶解。

⑪正己烷：分析纯。

⑫pH=6水：在水中加200g／L柠檬酸调pH到6。

⑩着色剂标准溶液：柠檬黄、13落黄、苋菜红、胭脂红、新红、赤藓红、亮蓝、靛蓝按其纯度折算为100％质量，配成1.00mg/mL的pH=6水溶液，临用时加pH=6水稀释成50.0μg/mL。经滤膜(HA0.45μm)过滤。

2、仪器

高效液相色谱仪，紫外检测器。

四、实验步骤

称取20.0～40.0g橘子汁，放入100mL烧杯中。含二氧化碳的样品加热驱除二氧化碳。

2、色素提取

①聚酰胺吸附法：样品溶液加200g／L柠檬酸调至pH=4，加热至60⁰C，将lg聚酰胺粉加少许水调成糊状，倒入样品溶液中，搅拌片刻，以G3垂熔漏斗抽滤，用60⁰C的水(pH=4)洗涤3～5次，然后用甲醇一甲酸混合液洗涤3～5次(含赤藓红的样品不能洗)，再用水洗至中。用乙醇-氨水-水混合液解吸3～5次，每次5mL，收集解吸液，加乙酸中和，蒸发至近干，加水溶解，定容至4mL。经滤膜(HAO.45μm)过滤，取lOμL进高效液相色谱仪。

②液-液分配法(适用于含赤藓红的样品)：将制备好的样品溶液放入分液漏斗中，加20mL盐酸、三正辛胺-正丁醇溶液(5+95)10～20mL，振摇，提取，分取有机相。重复此操作，合并有机相，用饱和硫酸钠溶液洗2次，每次10mL，分取有机相，放至蒸发皿中，水浴加热浓缩至10mL，转移到分液漏斗中，加入60mL正己烷，混匀。加氨水(2+98)提取2～3次，每次5mL。合并氨水层(含水溶性色素)，用正己烷洗2次，氨水层加乙酸调成中性，水浴加热蒸发至近干，加水溶解，定容至5mL。经滤膜(HA0.5μm)过滤，取lOμL进高效液相色谱仪。

3、高效液相色谱条件

①色谱柱：YWG-C₁₈，4.6mm×250mm，10μm，不锈钢柱。

②流动相：甲醇：0.02mol／L的CH₃COONH₄溶液(pH=4)。

③梯度洗脱：甲醇20％～35％，3％/min；35％-98％，9％/min；98％继续6min。

④流速：1mL/min。

⑤检测器：紫外检测器，波长254nm。

根据保留时间定性，外标峰面积法定量。

五、注意事项

1、样品在加入聚酰胺粉吸附色素之前，要用200g/L柠檬酸调至pH=4，因为聚酰胺粉在偏酸性(pH=4～6)条件下对色素的吸附能力较强，吸附较完全。

2、如果样品色素浓度太高，要用水适当稀释，因为在浓溶液中，色素钠盐的钠离子不容易解离，不利于聚酰胺粉吸附。

3、样液中的色素被聚酰胺粉吸附后，当用热水洗涤聚酰胺粉以便除去可溶性杂质时，要求水偏酸性，防止吸附的色素被洗脱下来，使定量结果偏低。

4、在提纯的样品溶液进行蒸发浓缩时，要控制水浴温度在70～80⁰C之间，使其缓慢蒸发，勿溅出皿外，另外要经常摇动蒸发皿，防止色素干结在蒸发皿的壁上。

参考资料：食品中有毒有害物质检测

相关链接：乙酸铵，聚酰胺粉，柠檬酸