纤维素酶研究进展

纤维素物质是世界上最丰富的却又未得到充分利用的可再生性物质资源宝库，它将是人类未来的能量、食物和化工原料的主要来源^[1]。合理开发和科学利用这一丰厚天然资源是世界各国研究开发的重点领域。利用一些生物产生的纤维素酶将其转化为人类急需的能源食物和化工原料，对于人类社会的可持续发展具有非常重要的意义^[2]。

纤维素酶是一种高活性生物催化剂，是降解纤维素生成葡萄糖的一组酶的总称。它是由葡聚糖内切酶(EG，C1或CMC酶)、葡聚糖外切酶(CBH，CX)、β-葡萄糖苷酶(BG)组成的诱导复合酶系^[1]。

纤维素酶广泛存在于自然界的生物体中。在细菌、真菌、动物体内等都能产生纤维素酶。一般用于生产的纤维素酶来自于真菌，比较典型的有木酶属(Trichoderma)、曲霉属（Aspergillus）和青霉属(Penicillium）。

1.纤维素酶的用途

纤维素酶现已广泛运用到医药、遗传、纺织、日用化工、造纸、环境、能源、食品发酵、饲料、工业洗涤、石油开采、资源再生、废水处理、农业、动物营养学、中草药有效成分的提取等各个领域，因而纤维素酶需求量将会逐步增加，其应用前景将十分广阔^[3]。

1.1纤维素酶在食品酿造业中的应用

1.1.1酿酒行业

在进行酒精发酵时添加纤维素酶可显著提高酒精和白酒的出酒率及原料的利用率，降低溶液的黏度，缩短发酵时间，而且酒的口感醇香，杂醇油含量低^[5,6]。

1.1.2酱油食醋酿造

在酱油的酿造过程中添加纤维素酶，可使大豆类原料的细胞膜膨胀软化破坏，使包藏在细胞中的蛋白质和碳水化合物释放，既可提高酱油浓度，改善酱油质量，又可缩短生产周期，提高生产率，并且使酱油各项主要指标均得到提高^[7,8]。

1.2纤维素酶在饲料工业上的应用

1.2.1制备低纤维饲料

纤维素酶能将天然纤维素降解成易消化的糖，且有很强降解纤维素的能力。利用纤维素酶这种特性，将粗纤维降解为有利于家禽吸收的低纤维，不仅降低了饲料加工的成本，易得的原料也满足了畜牧业的快速发展，且经过纤维素酶处理的低纤维饲料有利于畜禽的消化吸收，提高了饲料利用率^[9,10]。

1.2.2作为饲料添加剂

纤维素物质往往是很多畜禽的饲料之一，但自然界中除了一些反色动物具有消化纤维素的能力外，大多数生物没有此能力。因此在将纤维素类物质喂食牲畜时，经常会造成不易消化，生长发育不良的现象^[11]。而将纤维素酶作为饲料添加剂，不仅提高粗纤维和其他营养物质的酵解强度，消化吸收水平，而且能够调整肠道微生物区系结构，使之处于平衡状态，有效利用饲料中的纤维素，提高饲料的利用率^[5]。

1.2.3植物纤维原料酶水解生产饲料酵母

饲料酶母是重要的饲料蛋白资源，其需求量非常巨大，因而利用纤维素酶降解植物纤维原料来生产饲料酵母的前景十分广阔。传统的植物纤维原料水解方法为酸法水解。鉴于酸水解需高温、高压，对设备要求高，投资大，水解副产物多，糖得率低，水解液中有害物质多，不便于酵母繁殖等缺点，纤维素酶法水解替代酸水解用于植物原料生产饲料酵母是必然趋势^[5]。

1.3纤维素酶在能源中的应用

全球经济迅速发展的同时，能源短缺问题日益突出，利用纤维素降解产物来开辟新能源也随之成为了国内外研究的重点。目前生产生物酒精以淀粉类农作物为主，但其成本较高，是汽油的两倍，导致大规模生产应用受到限制，而且对于我国来讲，人口众多，粮食问题一直都是难以解决的头等大事，将大量的农作物用于生物能源的生产，也造成了“人车争粮”的现状^[11]而利用纤维素酶将纤维素降解为糖类再经过发酵生产酒精，整个流程经济，环保，简单便捷。因而将成为解决未来能源危机的重要途径之一。

2.样品的采集

样品采集集中于纤维素能够大量分解的地方，这些区域存在着能够产纤维素酶的微生物，拟在以下点进行样品的采集：（1）树林中的腐殖质及表层土壤微生物；（2）在反刍动物（牛、驴等）的瘤胃中微生物；（3）一些昆虫（白蚁等）胃肠道微生物。

3.产纤维素酶菌种富集的方法

微生物富集方法主要包括物理法和生物亲和法２大 类 常 用 物理方法包括过滤法、离心法等。生物亲和法是根据微生物特性将其与固相载体结合以实现分离 它可分为特异性结合与非特异性结合２种。磁性分离法是生物亲和分离法的一种。

3.1过滤法

过滤法富集微生物是将适当孔径的滤膜放入滤器，过滤样品。由于滤膜的作用而将微生物滞留在膜表面，使微生物与样品溶液分开 达到微生物富集目的^[13]。

3.2离心法

离心法是借助于离心力，对比重不同的物质进行分离的方法。一般常用直接离心法和密度梯度离心法来分离样品中的微生物。

3.2.1直接离心法

直接离心法是在不加入介质的条件下，直接对样品中的细菌进行离心分离，使大部分细菌沉降于管底，达到将细菌分离、富集的目的。然而，直接离心的同时样品中与靶细菌密度相近的其他成分也会随之沉淀，影响分离后细菌的纯度^[13]。

3.2.2密度梯度离心法

密度梯度离心法是用一定的介质在离心管内形成连续或不连续的密度梯度，将细菌混悬液置于介质的顶部（底部或混匀）根据细菌在密度梯度液中的比重不同，通过离心力的作用使靶细菌分离^[13]。

4. 产纤维素酶菌种分离的方法

现阶段对于菌种分离方法主要有稀释混合倒平板法、稀释涂布平板法、平板划线分离法等，利用这些方法都能将不同菌株分离出来。

4.1 稀释混合倒平板法

稀释混合倒平板法是先将待分离的含菌样品，用无菌生理盐水作一系列的稀释(常用十倍稀释法, 稀释倍数要适当)， 然后分别取不同稀释液少许(0.5-1.0ml)于无菌培养皿中， 再倾入已熔化并冷却至40℃左右的琼脂培养基，迅速旋摇，充分混匀。待琼脂凝固后，于恒温箱中倒置培养一定时间后，在琼脂平板表面或培养基中即可出现分散的单个菌落。挑取单一个菌落，一般再重复该法1-2次，结合显微镜检测个体形态特征，便可得到真正的纯培养物。但用这种方法分离菌种，有两个缺点：一是会使一些严格好氧菌因被固定在琼脂中间，缺乏溶氧而生长受影响，形成的菌落微小难于挑取；一是在倾入熔化琼脂培养基时，若温度控制过高，易烫死某些热敏感菌，过低则会引起琼脂太快凝固，不能充分混匀。

4.2稀释涂布平板法

稀释涂布平板法是将已熔化并冷却至约50℃(减少冷凝水)的琼脂培养基，先倒入无菌培养皿中，制成无菌平板。待充分冷却凝固后，将一定量(约0.1 ml)的某一稀释度的样品悬液滴加在平板表面，再用三角形无菌玻璃涂棒涂布，使菌液均匀分散在整个平板表面，倒置温箱培养后挑取单个菌落。重复培养1-2次，结合显微镜检测个体形态特征,便可得到真正的纯培养物。

4.3 平板划线分离法

先倒制无菌琼脂培养基平板，待充分冷却凝固后，用接种环以无菌沾取少量待分离的含菌样品，在无菌琼脂平板表面进行有规则的划线。划线的方式有连续划线、平行划线、扇形划线或其它形式的划线。通过这样在平板上进行划线稀释，微生物细胞数量将随着划线次数的增加而减少，并逐步分散开来。经培养后，可在平板表面形成分散的单个菌落。但单个菌落并不一定是由单个细胞形成的，需再重复划线1-2次，并结合显微镜检测个体形态特征，才可获得真正的纯培养物。

将采集得到的样品利用上述方法于刚果红培养基中进行初筛，并通过菌落形态、显微形态、生理生化形态的观察鉴定产纤维素酶菌株。

5.诱变筛选方法

从自然界中筛选到的天然产纤维素酶菌株，往往活力不高或者产酶组份不全，对其进行人工诱变处理后，能够筛选出生物学性状大幅度改良的高产纤维素酶的菌株。现今主要以此方法来获取高产纤维素酶菌株。将经过初筛鉴定的菌株用不同诱变处理（诱变剂、紫外等），然后利用上述方法再次筛选高产纤维素酶菌株，并保存筛选出来的菌株及镜检^[14,15]。高产纤维素酶菌株筛选步骤如下：

出发菌株→斜面培养（或摇瓶培养）→单细胞或单孢子悬液→诱变剂处理→平板分离→斜面培养（或摇瓶培养）→初筛→斜面培养（或摇瓶培养）→复筛→斜面培养（或摇瓶培养）→中试→生产实践。

6.高产纤维素酶工程菌的构建

运用现代分子生物学技术对产纤维素酶菌进行遗传改造，将纤维素酶基因同高效表达基因的启动子或染色体起始位点融合构建高效纤维素酶分泌菌，是提高纤维素酶生产效率的有效途径之一^[17]。

提取经诱变处理后得到的高产纤维素酶菌株纤维素酶基因，通过基因分离、重组、载入新的宿主细胞，那就可以构建含有纤维素酶基因全组份的高效产纤维素酶的工程菌。

7.发酵生产方法和工艺

对纤维素酶的制备一般采用微生物发酵方法。纤维素酶的工业化生产目前有固体发酵法、液体(深层)发酵法两种^[20]。

纤维素酶是诱导酶，其生物合成的调控受诱导物的约束。通常采用经过粉粹并预处理的富含植物纤维原料、废纸、各种酒糟等作为诱导物和主要碳源，添加适宜的氮源和无机盐等^[21]。

7.1固体发酵

固体发酵法又称麸曲培养法，是以秸秆粉、废纸、玉米秸秆粉为主要原料，拌入菌种后，装入盘或帘子上，摊成薄层，在培养室一定温度和湿度下进行发酵。其主要特点是发酵体系没有游离水存在，微生物是在有足够湿度的固态底物上进行反应，发酵环境接近于自然状态下的微生物生长习性，产生的酶系更全，有利于降解天然纤维素，且投资低、能耗低、产量高、操作简易、回收率高、无泡沫、需控参数少、环境污染小等。但固体发酵法易被杂菌污染，生产的纤维素酶分离纯化较难，且色素不易去除^[20]。

7.2 液态深层发酵

液态深层发酵又称全面发酵，是将秸秆等原料粉碎、预处理并灭菌后送至具有搅拌桨叶和通气系统的密闭发酵罐内，接入菌种，借强大的无菌空气或自吸的气流进行充分搅拌，使气、液面积尽量加大而进行发酵。其主要特点是培养条件容易控制，不易染杂菌，产物易提取，生产效率高，节省劳动力，适合大规模工业化生产。液态深层发酵是现代生物技术之一，已成为国内外重要的研究和开发工艺^[20]。

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