一般来说，反相HPLC的流动相包括有机相和水相，有机相常用的为色谱甲醇和乙腈，不太常用的还有四氢呋喃和异丙醇。甲醇有其性价比的优势，但是甲醇活性高，可能与某些样品发生反应，而且甲醇在低波长下有紫外吸收，会降低分析方法的灵敏度；乙腈虽然价格很高，毒性比甲醇大，但是洗脱能力比甲醇强，很少与样品发生反应，用作流动相系统压力要比甲醇低很多，且截止波长比甲醇低20nm，增加了检测出在低波长下才有吸收的杂质的可能性，所以我们一般倾向于多用乙腈，少用甲醇。但是当样品峰形不好或者分离不好时，更换溶剂是一个很好的选择，因为不同的溶剂可提供不同的选择性。

在反相色谱中，流动相中水相的pH和离子强度在开发对条件微小变化不敏感的耐用方法中非常重要。对于离子型化合物，典型样品的保留随pH改变而明显变化，因此控制pH对于保留和选择性的稳定非常重要，通常在pH2~4的条件下，保留时间对pH的微小改变稳定性最高，因此建议将这一pH范围作为大多数样品方法开发的起始pH，包括碱性化合物和一般的弱酸。考虑到重现性，所用的pH应高于或低于待分析物pKa或pKb上下一个pH单位。当待分析物pKa或pKb未知时，应测试一种以上流动相pH（如pH2.0和pH6.5缓冲盐溶液），可提供最好结果。

对流动相的优化主要体现在水相上。流动相pH值对色谱分离的影响有多钟方式，根据待分析物的结构性质，pH可能影响选择性、峰形和保留。如果是非极性较强或中性的化合物，pH对分离度和保留的影响一般不明显。如果是可离子化的化合物，如酸或碱，保留因子和选择性随pH改变非常明显。

（1）酸性分析物，应选择低pH缓冲液流动相，以防止分析物离子化。了解分析物的pKa，才能有效的选择流动相pH。缓冲范围应在其缓冲液离子pK值±1 pH单位，使流动相的优化具有一定的灵活性。例如，醋酸盐的pKa为4.8，缓冲范围为pH3.8~5.8。

（2）碱性化合物，在高pH条件下才能得到其非离子形态，但这对色谱柱不利。通常许多碱性化合物在低pH条件的保留就已经满足要求了，所以可选择低pH条件。如果选择高pH条件，则注意需选择耐强碱的色谱柱。

水里可以加酸、加碱、加盐，从而改变pH值、改善峰形、提高分离度。常用的酸有磷酸、三氟乙酸、甲酸、乙酸、高氯酸、甲基磺酸等。单纯做液相时，低波长下磷酸最合适；而做液质时首选三氟乙酸，或甲酸、乙酸。开发液相分析方法时流动相可首选0.1%的磷酸水溶液，然后再以此为基础做优化。在单独用酸不行的时候再考虑使用缓冲盐，缓冲盐的选择原则是：简单、稳定、缓冲能力强、配制简单，需要调pH值时要有相应的酸或碱。常用的缓冲盐是磷酸盐，主要是钾盐和钠盐，还有醋酸盐，常用的盐浓度在10~20mM左右（根据实际情况，有时可以选择更低或更高浓度，建议最高浓度不超过50mM）。

Waters资料，常规实验室建议使用的缓冲盐体系。