脯氨酸氨肽酶（prolylaminopeptidase，PAP，EC3.4.11.5）是一类能特异地水解多肽或蛋白N-端脯氨酸残基的氨肽酶，具有严格的底物特异性，在蛋白类食品水解加工产物苦味的去除，胶原蛋白水解等方面都有着较好的应用前景。脯氨酸氨肽酶的来源广泛，在动物、植物和微生物中都有存在，但目前大多数报道的脯氨酸氨肽酶都来源于微生物。

目前有关脯氨酸氨肽酶的研究主要集中在基因克隆、分离纯化和性质描述方面，而对脯氨酸氨肽酶的异源表达研究较少，表达量较低，无法进行大规模生产。Bacillussubtilis作为食品安全菌种，由于其遗传背景清晰，无致病性，蛋白分泌能力强，无密码子偏好性以及发酵周期短等优点已被广泛用于外源基因的表达宿主。

本研究将前期从日式酱油成品曲中筛选到的米曲霉胞内脯氨酸氨肽酶的cDNA基因克隆到枯草芽孢杆菌中进行表达，并通过优化培养基组成提高胞外分泌量，从而为工业化生产脯氨酸氨肽酶奠定基础。

1材料与方法

1.1菌株与质粒

E.coliJM109、枯草芽孢杆菌WB600、穿梭质粒pMA5、含目的基因的载体pMD19-pap。

1.2培养基

LB培养基：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl10g/L，pH7.0。TB培养基：蛋白胨12g/L，酵母粉24g/L，甘油4g/L，17mmol/LKH2PO4，72mmol/LK2HPO4。分泌培养基：蛋白胨12g/L，酵母粉24g/L，甘油4g/L，D-山梨醇50g/L，2mmol/LCaCl2，17mmol/LKH2PO4，72mmol/LK2HPO4。

1.3主要试剂

质粒DNA抽提试剂盒、DNA胶回收试剂盒购自上海生工生物工程股份有限公司；所有的底物均购自瑞士Bachem公司；PrimeSTAR誖DNAPolymerase、限制性内切酶、T4连接酶、DNAMarker购自宝生物工程（大连）有限公司；蛋白胨、酵母粉购自Oxoid公司；其他试剂均为国产分析纯。

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