1.4 实验药品及试剂

碳酸氢钠、氯化钾、硫酸镁、葡萄糖、磷酸二氢钠、氯化钠、氯化钙、氯化铁、氯化铝、醋酸钾[成都市科隆化学品有限公司]，氯乙酰胆碱[成都华夏化学试剂有限公司（中国成都）]，蓖麻油（河南省华龙药业有限公司），维拉帕米[Medchemexpress有限公司（美国）]，洛哌丁胺[西格玛化学公司（美国圣路易斯）]，色谱乙腈（成都市科隆化学品有限公司），纯化水（杭州娃哈哈集团有限公司），盐酸[成都市科隆化学品有限公司]、氯化铁、甲醇（重庆腾华化工有限公司）、醋酸钾和氯化铝用于粗提物的植物化学分析。蒸馏水（四川优普超纯科技有限公司）用于制备标准溶液、稀释液和生理盐溶液（Tyrode溶液）。

1.5仪器

家兔类通用实验器械，HW-400E恒温平滑肌槽（四川成都泰盟公司），BL-420F生物机能实验系统（四川成都泰盟公司），FT-100生物张力传感器（四川成都泰盟软件有限公司），优普纯水/超纯水制造系统（四川优普超纯科技有限公司），HH600-2B三用恒温水浴箱（金坛市科析仪器有限公司），电热恒温鼓风干燥箱（YDYQ,101-2A），粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司，FW177），电子分析天平（Mettle AE 240），旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂，RE-52AA），真空减压干燥箱（武汉奥普森试验设备有限公司，ZK 6050B）。

1.6 实验动物

选取110只健康昆明雌雄小鼠（18～22 g）以及42只健康家兔（2.0～2.5 kg），由川北医学院动物中心提供[许可证编号：SYXK(chuan)2013-076]，小鼠和家兔饲养于23～26℃、湿度适宜的实验室环境，12 h光照黑暗循环，期间可自由进食和饮水。本实验符合中国动物保护委员会的管理，并遵循动物伦理和实验准则。

1.7 实验方法

1.7.1 FS ext的急性毒性

取60只禁食4 h（可自由饮水）的小鼠随机分为0.5 g/kg FS ext试验组、1.0 g/kg FS ext试验组、2.0 g/kg FS ext试验组、4.0 g/kg FS ext试验组、8.0 g/kg FS ext试验组、16.0 g/kg FS ext试验组，每组10只，分别给予0.5 g/kg、1.0 g/kg、2.0 g/kg、4.0 g/kg、8.0g/kg、16.0 g/kg的FS ext进行灌胃，处理后的小鼠可自由饮水进食，记录14 d内小鼠的死亡情况和毒性迹象，建立相应的剂量-效应曲线，从而确定FS ext的半数致死剂量（LD50），以确定其安全性[9]。

1.7.2 对蓖麻油性腹泻的影响

另取50只小鼠随机分成阴性组、阳性组、0.25 g/kg FS ext试验组、0.50 g/kg FS ext试验组、1.00 g/kg FS ext试验组，每组10只，阴性组给予0.9%氯化钠溶液（20 ml/kg）灌胃，阳性组给予洛哌丁胺（4 mg/kg）灌胃，0.25 g/kg FS ext试验组、0.50g/kg FS ext试验组、1.00 g/kg FS ext试验组分别给予0.25、0.50、1.00 g/kg FS ext。给药30 min后，小鼠均给予蓖麻油0.4 ml灌胃，然后将每只小鼠放入单独的笼子中，地板衬有吸墨纸，将线网放置在离底部3 cm的笼中以使小鼠与吸墨纸隔开。观察4 h内以下指标：初始半固体粪便时间，固体、半固体、液体粪便数量。采用腹泻指数（EI）评估腹泻的严重程度。EI=固体粪便数量×1+半固体粪便数量×2+液体粪便数量×3。

1.7.3 离体标本制备

选取健康家兔，实验前禁食24 h，自由饮水。用木槌击致头昏，解剖家兔，以胃幽门与十二指肠交界处为起始部，取空肠并立即放入通有95%O2和5%CO2混合气的台氏液中，将内容物冲洗干净并剪去肠系膜，剪成1.5～2.0 cm数段，一端用线结扎固定于通气沟，另一端固定于张力换能器。给予前负荷1 g，浴槽内温度维持在（37.0±0.5）℃，通气沟以每秒1～2个气泡的速度持续通入混合气，待基线稳定后开始实验。

1.7.4 FS ext对家兔离体空肠平滑肌自发性收缩的影响

待空肠平滑肌张力稳定后，单剂量加入FS ext(0.01、0.03、0.10、0.30、1.00、3.00、10.00 mg/ml，这些浓度是累加所得，即后一个的浓度由前一个浓度累加，主要目的是为了观察家兔离体空肠平滑肌自发性收缩随FS ext的浓度变化而变化的趋势），以给药前的张力为100%，记录给药后空肠平滑肌自发性收缩的张力变化。按照上述方法，用维拉帕米（0.01、0.03、0.10、0.30、1.00、3.00、10.00μmol/L）处理家兔离体空肠平滑肌作为对照，记录给予维拉帕米后家兔离体空肠平滑肌自发性收缩的张力变化。

1.7.5 FS ext对由乙酰胆碱（ACh）和KCl诱导的家兔离体空肠平滑肌自发性收缩的影响

待空肠平滑肌张力稳定后，分别加入ACh(10μmol/L）和KCl(60mmol/L）预处理，出现最大波峰后，立即用台氏液冲洗肠管，等其稳定后，再次分别加入ACh(10μmol/L）和KCl(60μmol/L),15 min后，加入FS ext使其终浓度分别达0.01、0.03、0.10、0.30、1.00、3.00、10.00mg/ml，并记录空肠平滑肌自发性收缩稳定时的张力变化。按照上述方法，用维拉帕米（0.001、0.010、0.100、1.000、3.000μmol/L）处理家兔离体空肠作为对照，重复上述步骤，并记录此时空肠平滑肌自发性收缩稳定时的张力变化。

1.7.6 FS ext对由CaCl2诱导的家兔离体空肠平滑肌自发性收缩的影响

为确定FS ext对Ca2+内流的影响，首先让肠管处于Tyrode溶液中，待其张力稳定后，将Tyrode溶液换为含EDTA的无Ca2+高K+溶液，持续30 min以从组织中除去Ca2+。再将溶液换为不含EDTA的无Ca2+高K+溶液，持续15 min，然后再加入FS ext(0.3、1.0 mg/ml），构建CaCl2(3×10-5～3×10-2 mol/L）的量-效曲线，观察给予不同剂量FS ext后家兔离体空肠平滑肌自发性收缩率的变化。在加入维拉帕米（1μmol/L）的情况下，构建CaCl2(3×10-5～3×10-2 mol/L）的量-效关系曲线，观察空肠平滑肌自发性收缩率变化。在没有FS ext和维拉帕米预处理的情况下，将3×10-2 mol/L CaCl2诱导的家兔离体空肠平滑肌自发性收缩率认为是100%[12]。

1.8 统计学方法

采用SPSS 19.0软件进行数据分析，计量资料以表示，组间比较用单因素方差分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 植物化学分析

2.1.1 初步植物化学分析

对FS ext的初步植物化学分析表明其含有酚类、皂苷类和黄酮类化合物。

2.1.2 总黄酮的含量

FS ext中黄酮含量的测定表明，黄酮含量为8.13 mg/g。

2.1.3 高效液相色谱法检测FS ext中的化学成分

采用高效液相色谱法对FS ext中的化学成分进行检测，结果显示，FS ext中主要含连翘苷和连翘酯苷A。在上述1.3.3的色谱条件下，连翘苷和连翘酯苷A的分离度良好，空白、混合标准品、样品的色谱图见图1。

2.2 FS ext的急性毒性

在测量LD50的实验过程中，小鼠按不同剂量的FS ext进行灌胃后，在观察期内未出现任何死亡或毒性迹象。单次给予FS ext的剂量为16g/kg，小鼠在观察期内未出现任何的死亡及行为变化。

2.3 FS ext对小鼠蓖麻油性腹泻的影响

5组初始半固体粪便时间和EI比较，差异有统计学意义（P<0.05）。阳性组初始半固体粪便时间长于阴性组、0.25 g/kg FS ext试验组、0.50 g/kg FS ext试验组，差异有统计学意义（P<0.05);1.00 g/kg FS ext试验组初始半固体粪便时间长于阴性组、0.25 g/kg FS ext试验组，差异有统计学意义（P<0.05）。阴性组EI高于阳性组、1.00 g/kg FS ext试验组，差异有统计学意义（P<0.05);0.25 g/kg FS ext试验组、0.50 g/kg FS ext试验组EI高于阳性组，差异有统计学意义（P<0.05，见表2）。

2.4 FS ext对家兔离体空肠平滑肌自发性收缩的影响

台氏液对家兔离体空肠平滑肌自发性收缩无明显影响，差异无统计学意义（P>0.05，见图2）。FS ext对家兔离体空肠平滑肌表现出剂量依赖性解痉作用，即半最大效应浓度（EC50)=1.21 mg/ml(1.11～1.26mg/ml,n=6），见图3。图形类似于维拉帕米（0.01～10μmol/L），其EC50为0.51μmol/L(0.42～0.59μmol/L,n=6），见图4。

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