1、水：水是反相高效液相色谱法最重要的溶剂，它也是最难纯化和保持其特性的流动相之一。特别是在痕量分析检测器处于高灵敏度状态时，水的纯度（理论上水电阻率约为18.2MΩ·cm）至关重要。长时间使用纯度满足不了要求的水，有时会出鬼峰、怪峰。水的纯化可以采用蒸馏、离子交换、超纯水制备系统等方法。水中有机物可以用高锰酸钾或通过一根C₁₈柱去除。电蒸馏水或去离子水必须至少在全玻璃系统下重蒸馏一次，过滤、脱气后才能上机使用。在使用电化学检测器或其他高灵敏度检测器时，二次蒸馏设备需要采用全石英玻璃系统。水中容易滋生微生物，一定要用新鲜的，最好每天换水，夏季更换时间最长也不要超过3d。

可以采用下列程序检验水的纯度：首先泵100mL水通过C₁₈柱，然后跑一个线性梯度洗脱，流速为1mL／min，10min流动相甲醇从0升到100％，保持15min，通过在线紫外检测器测定。要求在0.08AUFS挡位基线漂移小于10％，几乎不出峰，即使出峰其峰高也小于满刻度值的3％～5％。

2、乙腈：乙腈为反相高效液相色谱常用的溶剂，实验室常用的只能满足紫外检测器的需要。有时很难符合荧光检测器和电化学检测器的要求。

3、甲醇：甲醇是反相高效液相色谱常用的溶剂之一，其杂质主要是水。它的主要问题也是有些特性满足不了荧光检测分析和电化学检测分析要求。

4、氯代烃类溶剂：在正相高效液相色谱中常用的二氯甲烷等氯代烃类溶剂中，添加稳定剂甲醇或乙醇。乙醇能够提高流动相的极性，缩短正相高效液相色谱分析中各组分的保留时间。各批次之间浓度的变化也许会影响重复性。国内市场上可能不容易买到不含稳定剂的氯代烃类溶剂，但是可以用氧化铝柱吸附的办法或者用水提取脱掉。不含稳定剂的氯代烃类溶剂会缓慢分解，特别是与其他溶剂共存时。分解生成的盐酸会腐蚀不锈钢部件。以戊烯为稳定剂的氯代烃类溶剂可避免产生上述问题。

5、醚类溶剂：这类溶剂中常添加稳定剂防止其氧化，如四氢呋喃中加有对苯二酚。这种稳定剂有紫外吸收，干扰紫外检测。可以在蒸馏中加入氢氧化钾去除。另外，这类溶剂中的氧化物可用氧化铝柱吸附净化。

（二）固定相

固定相亦称填料。液固吸附色谱法色谱柱中的填料就是以硅胶为主的吸附剂。液液分配色谱法色谱柱中的填料则是以超纯硅胶或杂化颗粒等为载体，载体表面上键合固定液。液相色谱固定相按化学组成分类可分为微粒硅胶、高分子微球、微粒多孔炭等主要类型；按结构和形状分为薄壳型和全孔型，无定型和球型；按填料表面改性与否可分为吸附型和化学键合型；也可以按洗脱模式分为吸附、液液分配、离子交换和凝胶渗透4类。在高效液相色谱填料的发展过程中曾使用过大颗粒全多孔硅胶，表面多孔硅胶即薄壳型填料（φ30μm）、小颗粒全多孔硅胶（φ3～10μm）。现在广泛采用的是人工合成的超纯小颗粒全多孔硅胶和杂化颗粒硅胶材料。颗粒度变化趋势见。

对载体的要求是孔容大（＞1mL／g），比表面积大（＞200mz／g），孔径为8～15nm。

一般认为，硅醇基官能团本身具有不同程度的酸性。微酸性的硅醇基团在分离中起重要作用，而硅氧烷键只有很少影响或没有影响。在相邻硅原子上的酸性最强的羟基由于形成分子内氢键而常常引起如化学吸附、色谱峰拖尾的效应。为了减轻这一影响，通常采用化学键合固定相。杂化颗粒是在超纯硅胶的基础上，引入硅碳。它虽然解决了一些问题，但耐碱、耐高压性能差。但在硅胶颗粒中引入亚乙基桥（bridgedethylenehybrid，BEH），较好地解决了上述问题，实现宽pH范围下超高效快速分离。表面带电杂化颗粒（chargedsurfacehybrid，CSH）是指颗粒表面带有低水平的正电荷，可在低离子强度流动相条件下提高样品载量和峰对称性，同时仍维持亚乙基桥键颗粒技术固有的机械稳定性与化学稳定性。