棉酚是从锦葵科植物陆地棉、树棉或草棉成熟种子、根皮以及茎干中提取分离得到的双羟基双萘醌类化合物，是一种黄色的多酚类物质。棉酚具有显著的抗生育作用，一度成为男性避孕药的研究热点，但由于其具有不可逆的无精症和低血钾症，使得研究陷入低迷。棉酚的研究主要集中在其药效和毒性机制方面，其在药物代谢方面研究较少，因此本研究采用UPLC－LTQ－OrbitrapMS技术，研究了棉酚在大鼠肝微粒体中的代谢产物，为进一步研究棉酚在体内的代谢和代谢酶奠定基础。

1实验

1.1仪器、试剂和材料

Accela600pump高效液相色谱仪与LTQ－OrbitrapXL质谱(配有电喷雾离子源(ESI)，Xcalibur2.1工作站)，美国ThermoScientific公司;HimacCP100MX型超高速冷冻离心机，日本Hitachi;棉酚(纯度＞98%)，中国药检检定研究院(批号:14110105);乙腈(色谱级)，ThermoFisherScientific;还原型辅酶ⅡNADPH，购于北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司公司;超纯水，MilliporeSynergyUV型超纯水机制备;Tris－HCl缓冲溶液(含50mmol/LTris和1.15%KCl，pH=7.4);其他试剂均为分析纯，购于北京化工厂。清洁级SD大鼠，雄性，体重为230～270g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供(实验动物质量合格许可证号:SCXK(京)2013－0001)。

1.2大鼠肝微粒体的制备

6只大鼠断头处死后，立即取出肝脏，用Tris－HCl缓冲溶液、洗至土黄色，滤纸擦净，称重，按1∶3(g∶mL)加入Tris－HCl缓冲溶液，用内切式组织匀浆机冰上匀浆。最后采用差速离心法制备肝微粒体。

1.3温孵条件和样品处理

肝微粒体体外温孵系统在Eppendorf管中进行，其总体积0.5mL，含有大鼠肝微粒体蛋白(最终浓度为0.5mg/mL)，MgCl2(最终浓度为5mmol/L)，磷酸缓冲液(最终浓度为100mmol/L，pH=7.4)，棉酚(最终浓度为50μmol/L)，将此反应体系在37℃恒温水浴摇床中预孵育10min后，加入1mmol/LNADPH启动反应，Tris－HCL缓冲溶液补足体积，在37℃恒温水浴摇床中温孵4h后，加入冰冷的乙腈溶液1mL终止反应，在4℃下15000g离心30min，取上清液过0.22μm的微孔滤膜，经UPLC－MS/MS分析。空白样品为除不加入棉酚外，其余同上述所有操作过程。所有体外温孵样品均重复三次。

1.4液相和质谱条件

色谱柱为AcquityUPLCBEHC18柱(2.1mm×50mm，1.7μm);流动相:A为水，B为乙腈，梯度洗脱方式，0～2min，5%B;2～3min，5%～80%B;3～10min，80%～95%B;10～14min，95%B;14～15min，95%～5%B;15～18min，5%B。进样体积为2μL;流速为0.3mL/min，柱温为室温。电喷雾离子源负离子检测模式(－ESI)，毛细管电压30V，喷雾电压3.0kV，毛细管温度350℃，鞘气30arb，辅助气10arb，CID碰撞池碰撞能量35%。一级扫描分辨率为FWMH30000;扫描范围为m/z100～1000。数据采集系统为Xcalibur2.1。

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