咖啡豆α-半乳糖苷酶(α-Gal)一般从咖啡豆中提取，但从咖啡豆中得到的α-Gal比较少，不能满足应用研究。2005年，Marraccini等报道发芽咖啡豆中的α-Gal酶活普遍高于咖啡豆(绿咖啡豆)来源的α-Gal。为此，笔者在国外最新研究进展的基础上，以发芽咖啡豆为原料，采用(NH4)2SO4沉淀、离子交换色谱、凝胶过滤色谱分离纯化发芽咖啡豆α-Gal，并用变性电泳技术分析该酶的纯度与分子量，为下一步研究发芽咖啡豆α-Gal的性质打下基础。

1材料与方法

1．1试剂

发芽咖啡豆α-半乳糖苷酶(实验室自制);DEAE-SepharoseFastFlow填料、SephacrylS-200-HR填料(Pharmacia上海公司);对硝基苯酚-α-半乳糖苷(p-Nitrophenyl-α-D-galactopyranoside，PNPG)和蜜二糖(Sigma-Aldrich上海公司)。

1．2仪器与设备

HT多功能酶标仪;BiologicDuoFlow蛋白层析系统;MINIPROTEINⅢ电泳系统;ChemiDocXRS凝胶成像系统(美国Bio-Tek公司);Direct-Q3超纯水系统(美国Millipore公司)。

1．3方法

1．3．1α-Gal分离纯化工艺

粗酶液↓(NH4)2SO4沉淀，4℃静置4h，冷冻离心，沉淀溶解于少量超纯水酶溶液↓透析(至无NH4+离子)浓缩液↓DEAE-SepharoseFastFlow阴离子交换柱，0～0．4mol/LNaCl梯度洗脱活力峰↓SephacrylS-200-HR凝胶过滤纯化酶。

1．3．1．1粗酶液的制备

以发芽培养35d的发芽咖啡豆为原料，提取液为水溶液(0．9%NaCl，0．1mmol/LEDTA)，pH4．8，料液比1∶5，时间30min，搅拌速度100r/min提取酶蛋白，得到的酶液即为粗酶液。

1．3．1．2(NH4)2SO4分级沉淀

取相同的粗酶液各20ml于烧杯中，缓慢加入不同饱和度的硫酸铵，一边加入，一边缓慢搅拌。硫酸铵全部溶解后，停止搅拌，静置4h，冷冻离心(10000r/min，10min)，沉淀溶于超纯水，装入透析袋中透析，透析液冷冻干燥，粉末溶解于少量超纯水中，得到酶液，测定蛋白浓度和酶活。

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