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浅谈鲤春病毒血症病毒焦磷酸测序检测技术的建立

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大C 0 447 2021-12-15
【摘要】通过收集鲤春病毒血症病毒基因序列,设计了鲤春病毒血症病毒最为保守的指纹序列,以及测序引物,建立了鲤春病毒血症病毒焦磷酸测序检测方法。对所构建的鲤春病毒血症病毒焦磷酸检测方法进行特异性试验和灵敏度检测,试验结果表明所建立的方法特异性好,在8种鱼类病毒中能够特异性检测出目的病毒,检测方法灵敏度高,最低检出核酸量为10pg/~L。对建立的焦磷酸测序检测方法进行了实际应用研究,选取国内采集与进口的鱼类样本共计8O批次进行鲤春病毒血症病毒检测。结果显示,焦磷酸测序检测方法可以有效的检出常规RT—PCR不能检出的假阴性样本和弱阳性样本,该方法的灵敏度和特异性可以满足水生动物疫病检测的需要。
  • 鲤春病毒血症病毒(SpringViremiaofCarpVi—rus,SVCV)又称鲤鱼弹状病毒,是鱼类强致病性病毒之一。鲤春病毒血症会引起鲤科鱼类急性出血性疾病,该病为必须向世界动物卫生组织申报的疫病。鲤春病毒血症病毒会造成鱼类出现传染性出血性坏死,死亡率高达90,损失极其惨重。鲤春病毒血症病毒在欧洲广为流行。

    鲤春病毒血症病毒在美洲的太平洋沿岸,从秘鲁到墨西哥的虹鳟(Oncorhyn—chusmykiss)养殖场流行,偶尔也发现在这些地区的野生虹鳟有鲤春病毒血症病毒感染。美洲的大西洋、加勒比海和墨西哥湾的沿海地区养殖金鱼(Carassiusauratus)也发现了鲤春病毒血症病毒,但在当地野生金鱼种群中尚未发现鲤春病毒血症病毒感染。2002年美国首次报道在国内分离出两株鲤春病毒血症病毒,2006年加拿大首次报道分离出鲤春病毒血症病毒。我国在2004年首次分离出鲤春病毒血症病毒,标志着该病毒已经随着国际贸易增长传人境内嘲。

    鲤春病毒血症病毒是影响世界鱼类养殖业的主要病害,如何控制好疫病的爆发,做好病害防治,成为目前我国水产养殖业和进出口行业的重中之重。参照世界动物卫生组织《水生动物疫病诊断手册》及我国的出入境检验检疫行业标准。,细胞分离与RT—PCR方法是目前普遍适用且有效的两种检测方法。细胞分离操作复杂,需要盲传2代,检测周期长,而RT—PCR方法必须与测序联合使用才能作为疫病确诊的依据。RT—PCR方法作为一种常规的核酸检测方法,其操作需要经历核酸提取、核酸扩增、琼脂糖电泳、扩增产物回收以及扩增产物测序5个阶段,全程耗时3~5d,耗时长。如果PCR扩增产物含量低而不能达到测序要求时,测序将无法进行,进而不能对检测到的疑似阳性样品进行最终确诊。

    在实际检测工作中,需要建立一种对病原体一段很短但是特别保守的片段进行测序的方法,这种方法要求快速简洁并满足对病原体大量检测的需要。因焦磷酸测序检测方法能够短时间内精准测出短DNA片段的序列,同时可以测96份样品口,操作简便,能够形成标准化的检测流程,特别适合水生动物疫病病原体的检测与确证。本研究以鲤春病毒血症病毒为研究对象,设计特异的测序引物及其指纹序列,优化焦磷酸测序条件,建立特异、准确的鲤春病毒血症病毒焦磷酸测序检测技术体系,为水生动物病毒病害的监测和防控提供新的检测方法。

     


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