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焦磷酸测序检测CYP2C19基因多态性方法的建立

大C 0 451 2021-12-15

【摘要】目的建立一种基于焦磷酸测序技术的用于CYP2C19基因多态性快速检测的方法。方法选择2016年12月~2017年3月于贵州省人民医院行健康体检者50名，提取其基因组DNA，针对CYP2C19*2（681G>A）、CYP2C19*3（636G>A）、CYP2C19*17（-806C>T）3个单核苷酸多态性（SNP）位点分别设计一套PCR扩增引物和焦磷酸测序引物。将PCR扩增产物制备成单链测序模板，用QiagenPyroMarkQ24焦磷酸测序仪进行测序和基因型分析，采用Sanger一代测序技术对焦磷酸测序结果进行验证。结果根据出峰的碱基和峰高可清楚判断出3个SNP位点的不同基因型，检测结果与Sanger测序结果完全一致。50名健康体检者中检出CYP2C19超快代谢型1例，快代谢型22例，中代谢性22例，慢代谢型5例。

氯吡格雷是临床上常用的抗血小板聚集的药物之一，冠状动脉介入术（percutaneouscoronaryintervention，PCI）后患者需长期服用氯吡格雷来进行抗血小板治疗，但临床上部分患者会出现氯吡格雷抵抗。

氯吡格雷的主要代谢酶为细胞色素P4502C19，其编码基因CYP2C19的多态性是影响氯吡格雷疗效的主要遗传因素。CYP2C19的等位基因以CYP2C19*1（野生型）、CYP2C19*2、CYP2C19*3和CYP2C19*17较常见。超快代谢型的基因型为*1/*17、*17*17，快代谢型的基因型为*1/*1，中代谢型的基因型为*1/*2、*1/*3，慢代谢型的基因型为*2/*2、*3/*3和*2/*。本研究采用焦磷酸测序技术建立了一种CYP2C19基因多态性检测方法，并用Sanger测序法对其准确性进行验证。

1对象与方法

1.1对象

选择2016年12月~2017年3月贵州省人民医院健康体检成人50名，其中男21名，女29名，平均年龄为（35.7±9.7）岁。

1.2主要仪器与试剂

NP968核酸自动提取仪（西安天隆科技有限公司）；美国ABIVeriti96PCR仪（美国ABI生物系统公司）；QiagenPyroMarkQ24焦磷酸测序仪（德国凯杰公司）；PCR扩增引物和焦磷酸测序引物（上海生工生物有限公司）。

1.3方法

1.3.1基因组DNA的提取

根据天隆NP968核酸自动提取仪的说明书进行全血DNA提取，对DNA样本进行浓度和纯度检测，置于-20℃保存备用。

1.3.2CYP2C19多态性位点的引物设计

在NCBI上分别下载CYP2C19*2（681G>A）、CYP2C19*3（636G>A）和CYP2C19*17（-806C>T）3个单核苷酸多态性（singlenucleotidepolymorphism，SNP）位点上下游各1kb范围的基因序列，采用PyroMarkAssayDesignSoftware2.0（德国凯杰公司）软件设计PCR引物和焦磷酸测序引物。见表1。

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