3.2补阳还五汤及其给药人血浆、尿液药物化学成分鉴定

本研究应用UHPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS技术对补阳还五汤及其给药人血浆和尿液药物化学成分进行了分析，在分析过程中根据精确相对分子质量、分子离子特征碎片峰及其碎裂规律，在补阳还五汤中共鉴定了55个化合物；给药后人的血浆中鉴定了34个化合物；在尿液中鉴定了23个化合物，结果见表1。

3.3补阳还五汤主要药物化学成分的裂解规律

黄酮类成分的裂解规律：研究发现补阳还五汤及其在人血浆和尿液中黄酮及其苷类化合物的数量较多，且在正离子模式下的质谱响应较好，例如牡荆素、红橘素、木犀草素和毛蕊异黄酮及其苷类。以补阳还五汤中主要活性成分毛蕊异黄酮苷为例，其色谱保留时间为8.72 min，准分子离子峰为m/z 447.127 8[M+H]+，产生的二级特征离子碎片有m/z 285.075 1[M+H-C6H10O5]+为毛蕊异黄酮苷脱去1个葡萄糖后的特征碎片离子，m/z166.984 3[M+H-C13H14O7]为毛蕊异黄酮苷的基本母核经碎裂后得到的离子碎片。毛蕊异黄酮苷对照品提取离子流色谱图(extracted ion chromatogram,XIC)和在汤剂中质谱碎裂规律见图2~3。

苯酸类成分的裂解规律：研究发现补阳还五汤及其在人血浆和尿液中苯酸类化合物的数量较多，且在正离子模式下的质谱响应较好，例如阿魏酸、绿原酸、没食子酸和高藜芦酸等。以补阳还五汤中主要活性成分阿魏酸为例，其色谱保留时间为7.12 min，准分子离子峰为m/z 195.065 0[M+H]+，产生的二级特征离子碎片有m/z 177.054 5[M+H-H2O]+为阿魏酸脱去1个H2O后的特征碎片离子，m/z 149.012 1[M+H-H2O-CO]+为阿魏酸脱去1个H2O后再脱去1个CO的特征碎片离子。阿魏酸对照品XIC图和在汤剂中质谱碎裂规律见图4~5。

苯酞类成分的裂解规律：研究发现补阳还五汤及其在人血浆和尿液中苯酞类化合物的数量较多，且在正离子模式下的质谱响应较好，例如洋川芎内酯A、藁本内酯和洋川芎内酯H等。以补阳还五汤中主要活性成分洋川芎内酯H为例，其色谱保留时间为10.05 min，准分子离子峰为m/z225.118[M+H]+，产生的二级特征离子碎片有m/z207.101 4[M+H-H2O]+为洋川芎内酯H脱去1个H2O后的特征碎片离子，m/z 189.090 8[M+H-2H2O]+为洋川芎内酯H脱去2H2O个的特征碎片离子。洋川芎内酯H对照品XIC图和在汤剂中质谱碎裂规律见图6~7。

皂苷类成分的裂解规律：研究发现补阳还五汤主要活性成分黄芪皂苷Ⅲ，其在负离子模式下的质谱响应较好，色谱保留时间为13.19 min，准分子离子峰为m/z 783.455 7[M-H]和m/z 843.477 7[M+CH3COO]，产生的二级特征离子碎片有m/z621.063 5[M-H-C6H10O5]+为黄芪皂苷Ⅲ脱去1个葡萄糖后的特征碎片离子，m/z 469.051 0[M-HC6H10O5-C5H9O4-H2O-2H]为黄芪皂苷Ⅲ脱去1个葡萄糖，脱去1个木糖，1个水和2个氢后的特征碎片离子，此碎裂规律与文献报道一致，黄芪皂苷Ⅲ对照品XIC图和在汤剂中黄芪皂苷Ⅲ[M-H]质谱碎裂规律见图8~9。

4讨论

本研究建立的检测方法在16 min完成了补阳还五汤及其在人血浆和尿液中的药物化学成分的检测，一共鉴定了61个化合物。本研究采用的UHPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS技术，与文献报道的HPLC-DAD-TOF/MS和UPLC-Q-TOF-MS/MS技术相比，具有更快的分析速度、更高的准确度和灵敏度。本研究在人的血浆中分析鉴定了34个化合物，尿液中分析鉴定了23个化合物。这些成分主要是黄酮、苯酸和苯酞，这与文献猪的血清中主要成分存在一定的差异，猪的血清中主要成分以黄酮类化合物为主，其他化合物并没有检测到，这可能是当时的技术平台和人与动物之间的吸收和代谢差异引起的。在人的血浆中和尿液中鉴定的化合物已被证明具有治疗脑卒中的作用，如黄酮类化合物的芦丁、毛蕊异黄酮、芒柄花素、毛蕊异黄酮苷和槲皮素等在体外已经证明其可降低损伤大鼠脑细胞流动性。苯酸类化合物阿魏酸、绿原酸、没食子酸等具有降低主动血管炎症、改善急性心肌缺血、保护神经细胞线粒体功能而降低神经细胞损伤等作用。苯酞类成分洋川芎内酯A、藁本内酯和洋川芎内酯H等具有在抗氧化损伤、抗炎镇痛、抗凝及抗血小板聚集、舒张血管等作用。结合各单个化合物药理活性相关报道，初步推断人血浆和尿液的药效成分可能为补阳还五汤在人体内发挥作用的药效物质基础。

中药进入体内后发挥药效的物质有可能是药物原型，也会是药物的代谢产物。在前期研究中发现，补阳还五汤的各个成分进入人体后，在血浆样本和尿液样本中检测的代谢产物相对较少。目前还未见对补阳还五汤吸收进入人体后的代谢产物进行研究的文献报道。本研究将在现有的研究基础上优化实验条件，进一步研究补阳还五汤进入人体后的代谢产物和其代谢途径，为进一步揭示补阳还五汤的药效物质基础提供实验参考。

本研究应用UHPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS技术完成了补阳还五汤和其给药后在人血浆及尿液中药物化学的快速分析，为揭示补阳还五汤治疗缺血性脑卒中药效物质基础提供了参考。

声明：本文所用图片、文字来源《中国现代应用药学》2020年7月，版权归原作者所有。如涉及作品内容、版权等问题，请与本网联系

相关链接：相对分子质量，牡荆素，绿原酸，阿魏酸