小肠结肠炎耶尔森氏菌的检测方法

一、设备和材料

除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其他设备和材料如下:

1.1 冰箱:0℃~4℃。

1.2 恒温培养箱:26℃±1℃、36℃±1℃。

1.3 显微镜:10倍~100倍。

1.4 均质器。

1.5 天平:感量0.1g。

1.6 灭菌试管:16mm×160mm、15mm×100mm。

1.7 灭菌吸管:1mL (具0.01mL刻度)、10mL (具0.1mL刻度)。

1.8 锥形瓶:200mL、500mL。

1.9 灭菌平皿:直径90mm。

1.10 微生物生化鉴定试剂盒或微生物生化鉴定系统。

二、培养基和试剂

2.1 改良磷酸盐缓冲液:

2.2 CIN-1培养基(CepulodinIrgasanNovobiocinAgar)

2.3 改良Y培养基(AgarY,Modified)

2.4 改良克氏双糖培养基。

2.5 糖发酵管

2.6 鸟氨酸脱羧酶试验培养基。

2.7 半固体琼脂

2.8 缓冲葡萄糖蛋白胨水[甲基红(MR)和V-P试验用]。

2.9 碱处理液

2.10 尿素培养基

2.11 营养琼脂

2.12 小肠结肠炎耶尔森氏菌诊断血清。

三、操作步骤

3.1 增菌

以无菌操作取25g(或25mL)样品放入含有225mL改良磷酸盐缓冲液增菌液的无菌均质杯或均质袋内,以8000r/min均质1min或拍击式均质器均质1min。液体样品或粉末状样品,应振荡混匀。均质后于26℃±1℃增菌48h~72h。增菌时间长短可根据对样品污染程度的估计来确定。

3.2 碱处理

除乳与乳制品外,其他食品的增菌液0.5mL与碱处理液4.5mL充分混合15s。

3.3 分离

将乳与乳制品增菌液或经过碱处理的其他食品增菌液分别接种于CIN-1琼脂平板和改良Y 琼脂平板,26℃±1℃培养48h±2h。典型菌落在CIN-1上为深红色中心,周围具有无色透明圈(红色牛眼状菌落),菌落大小为1mm~2mm,在改良Y琼脂平板上为无色透明、不黏稠的菌落。

3.4 改良克氏双糖试验

分别挑取5.3中的可疑菌落3个~5个,分别接种于改良克氏双糖铁琼脂,接种时先在斜面划线,再于底层穿刺,26℃±1℃培养24h,将斜面和底部皆变黄且不产气的培养物做进一步的生化鉴定。

3.5 尿素酶试验和动力观察

用接种环挑取一满环5.4得到的可疑培养物,接种到尿素培养基中,接种量应足够大,振摇几秒钟,26℃±1℃培养2h~4h。将尿素酶试验阳性菌落分别接种于两管半固体培养基中,于26℃±1℃和36℃±1℃培养24h。将在26℃有动力而36℃无动力的可疑菌培养物划线接种营养琼脂平板,进行纯化培养,用纯化物进行革兰氏染色镜检和生化试验。

3.6 革兰氏染色镜检

将纯化的可疑菌进行革兰染色。小肠结肠炎耶尔森氏菌呈革兰氏阴性球杆菌,有时呈椭圆或杆状,大小为(0.8μm~3.0μm)×0.8μm

3.7 生化鉴定

3.7.1 从5.5中的营养琼脂平板上挑取单个菌落接种生化反应管,生化反应在26℃±1℃进行。

3.7.2 如选择微生物生化鉴定试剂盒或微生物生化鉴定系统,可根据5.6镜检结果,选择革兰阴性球杆菌菌落作为可疑菌落,从5.5所接种的营养

琼脂平板上挑取单菌落,使用微生物生化鉴定试剂盒或微生物生化鉴定系统进行鉴定。

3.8 血清型鉴定

除进行生化鉴定外,可选择做血清型鉴定。在洁净的载玻片上加一滴O 因子血清,将待试培养物混入其内,使成为均一性混浊悬液,将玻片轻轻摇动0.5min~1min,在黑色背景下观察反应。如在2min内出现比较明显的小颗粒状凝集者,即为阳性反应,反之则为阴性,另用生理盐水作对照试验,以检查有无自凝现象

四、结果与报告

综合以上及生化特征报告结果,报告25g(或25mL)样品中检出或未检出小肠结肠炎耶尔森氏菌。

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