三、色谱基本分离方程
（一）分离度
分离度R是一个综合性指标。
分离度是既能反映柱效率又能反映选择性的指标，称总分离效能指标。分离度又叫分辨率，它定义为相邻两组分色谱峰保留值之差与两组分色谱峰底宽总和之半的比值，即
R=2(tr2-tr1)/(W1+W2)
R值越大，表明相邻两组分分离越好。一般说，当R<1时，两峰有部分重叠；当R＝1时，分离程度可达98％；当R＝1.5时，分离程度可达99.7％。通常用R＝1.5作为相邻两组分已完全分离的标志。
分离度与理论塔板数的关系还受热力学性质的影响。当固定相确定，被分离物质对的a确定后，分离度将取决于n。这时，对于一定理论板高的柱子，分离度的平方与柱长成正比，
即
(R1/R2)²=nl/n2=L1/L2
说明用柱长较长的色谱柱可以提高分离度，但延长了分析时间，因此，提高分离度的好方法是制备出一根性能优良的柱子，通过降低板高，以提高分离度。
第二部分固定相和流动相
在色谱分析中，如何选择最佳的色谱条件以实现最理想分离，是色谱工作者的重要工作，也是用计算机实现HPLC分析方法建立和优化的任务之一。本章着重讨论填料基质、化学键合固定相和流动相的性质及其选择。

一、基质（基体）

HPLC填料可以是陶瓷性质的无机物基质，也可以是有机聚合物基质。［无机物基质主要是硅胶和氧化铝。无机物基质刚性大，在溶剂中不容易膨胀。有机聚合物基质主要有交联苯乙烯－二乙烯苯、聚甲基丙烯酸酯。有机聚合物基质刚性小、易压缩，溶剂或溶质容易渗入有机基质中，导致填料颖粒膨胀，结果减少传质，最终使柱效降低。
1．基质的种类
1）硅胶
硅胶是HLC填料中最普遍的基质。除具有高强度外，还提供一个表面，可以通过成熟的硅烷化技术键合上各种配基，制成反相、离子交换、疏水作用、亲水作用或分子排阻色谱用填料。硅胶基质填料适用于广泛的极性和非极性溶剂。缺点是在碱性水溶性流动相中不稳定。通常，硅胶基质的填料推荐的常规分析pH范围为2-8。
硅胶的主要性能参数有
①平均粒度及其分布。
②平均孔径及其分布。与比表面积成反比。
③比表面积。在液固吸附色谱法中，硅胶的比表面积越大，溶质的k值越大。
④含碳量及表面覆盖度（率）。在反相色谱法中，含碳量越大，溶质的k值越大。
⑤含水量及表面活性。在液固吸附色谱法中，硅胶的含水量越小，其表面硅醇基的活性越强，对溶质的吸附作用越大。
⑥端基封尾。在反相色谱法中，主要影响破性化合物的峰形。
⑦几何形状。硅胶可分为无定形全多孔硅胶和球形全多孔硅胶，前者价格较便宜，缺点是涡流扩散项及柱透性差：后者无此缺点。

⑧硅胶纯度。对称柱填料使用高纯度硅胶，柱效高，寿命长，碱性成份不拖尾。
2）氧化铝
具有与硅胶相同的良好物理性质，也能耐较大的pH范围。它也是刚性的，不会在溶剂中收縮或膨胀。但与硅胶不同的是，氧化铝键合相在水性流动相中不稳定。不过现在已经出现了在水相中稳定的氧化铝键合相，并显示出优秀的pH稳定性。
3）聚合物
以高交联度的苯乙烯－乙烯苯或聚甲基丙烯酸酯为基质的填料是用于普通压力下的HPLC，它们的压力限度比无机填料低。苯乙烯ニ乙烯苯基质疏水性强。使用任何流动相，在整个PH范围内稳定，可以用NaH或强碱来清洗色谱柱。甲基丙烯酸酯基质本质上比苯乙烯二乙烯苯疏水性更强，但它可以通过适当的功能基修饰变成亲水性的。这种基质不如苯乙烯二乙烯苯那样耐酸破，但也可以承受在pH13下反复冲洗。
所有聚合物基质在流动相发生变化时都会出现膨胀或收缩。用于HPLC的高交联度聚合物填料，其膨胀和收缩要有限制。溶剂或小分子容易滲入聚合物基质中，因为小分子在聚合物基质中的传质比在陶瓷性基质中慢，所以造成小分子在这种基质中柱效低。对于大分子像蛋白质或合成的高聚物，聚合物基质的效能比得上陶密性基质。因此，聚合物基质广泛用于分离大分子物质。
2．基质的选择
硅胶基质的填料被用于大部分的HPLC分析，尤其是小分子量的被分析物，聚合物填料用于大分子量的被分析物质，主要用来制成分子排阻和离子交换柱。