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动物细胞基因组DNA提取
实验原理
真核生物的DNA是以染色体的形式存在于细胞核内,制备DNA将DNA与蛋白质、脂类和糖类等分离,同时保持DNA分子的完整。提取DNA的过程是指将分散好的组织细胞在含SDS(十二烷基硫酸钠)和蛋白酶K的溶液中消化分解蛋白质,再用酚和氯仿/异戊醇抽提分离蛋白质,得到的DNA溶液经乙醇沉淀使DNA从溶液中析出。蛋白酶K的重要特性是能在SDS和EDTA(乙二胺四乙酸二钠)存在下保持很高的活性。
在提取DNA的反应体系中,SDS用于细胞膜、核膜,并使组织蛋白与DNA分离,EDTA则抑制细胞中Dnase活性;而蛋白酶K可将蛋白质降解成小肽或氨基酸,使起与DNA分子分离开来。
实验材料
(1)细胞裂解缓冲液: Tris (pH8.0) 100 mmol/L ;EDTA (pH 8.0) 500 mmol/L; NaCL 20 mmol/L; SDS 10% ;胰RNA酶 20ug/ml。
(2)蛋白酶K: 称取20mg蛋白酶k溶于1ml灭菌的双蒸水中,用一次性过滤器过滤除菌,-20℃备用。
(3)TE缓冲液(pH 8.0),高压灭菌后室温贮存。
(4)酚:氯仿:异戊醇=25:24:1(体积比)。
(5)NaAc 3 mol/L。
(6)异丙醇、冷无水乙醇、70%乙醇、灭菌水。
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