灵芝发酵粉中三萜化合物提取、纯化及结构初步分析（三）

①模拟的建立及其显著性检验对表2的试验数据进行二次模拟回归分析，得到三萜化合物得率（Y）对料液比（A）、回流时间（B）和温度（C）的二次多项回归方程：Y=0.67＋6.000×10^-3A-8.525×10^-3B-6.150×10^-3C-0.020AB-2.700×10-3AC-8.900×10-3BC0.056A²-0.079B²-0.031C²。其分析结果见表3。

由表3可知，模型p＜0.0001，说明试验选用的二次多项模型差异极显著。失拟项p＞0.05，表示不显著，即该模型对本实验的拟合程度良好，可以较好地描述各因素与响应值之间的真实关系。其中R²=0.9932，表明自变量和响应值之间的关系显著，调整系数R²_Adj=0.9845，说明该模型能够解释98.45%的响应值变化，试验误差小，可以运用此模型对灵芝发酵粉三萜化合物提取工艺进行分析和预测。一次项A、B、C对响应值三萜得率的影响达到显著水平，二次项A²、B²、C²对其影响极显著，AB、BC交互作用显著说明不同提取条件与灵芝发酵粉三萜提取得率之间不是简单的线性关系。

②响应面交互作用分析

为确定各因素交互作用对灵芝发酵粉中三萜化合物提取得率的影响，根据二次模拟回归方程绘出响应面及等高线图，见图7至图9。

图7、图9等高线形状为椭圆形，而图8等高线形状为圆形，表明料液比和回流时间、回流时间和回流温度的交互作用显著，料液比和回流温度的交互作用不显著。

③最佳提取条件确定

通过回归方程求得优化后的三萜化合物提取条件为：料液比1∶30.66（g/mL）、回流时间2.94h，回流温度84.53℃。为方便试验操作，调整条件为料液比1∶30（g/mL）、回流时间3h、回流温度85℃。验证试验测得三萜类化合物的平均得率为0.6760mg/g，与预测值0.6694mg/g相比误差为0.98%，可见，通过响应面优化得到的三萜化合物的提取条件比较可靠。

2、灵芝三萜粗提物的分离纯化及结构鉴定结果

（1）灵芝三萜的高效液相色谱检测

灵芝三萜粗提物经二次柱层析分部收集后，合并单一斑点的流分进行高效液相色谱检测，结果见图10。

由图10可以看出，流动相为2%乙酸溶液∶乙睛=70∶30时，检测出样品中有2个峰，说明样品中有2个不同组分，分别保留时间4.039min、4.234min。

（2）紫外光谱扫描分析

由图11可知，该物质紫外谱图在280nm、260nm波长处无明显吸收峰，说明经过前期硅胶柱层析后得到的三萜类化合物比较纯，基本不含有蛋白质及核酸等杂质。其最大吸值在波长237nm处，具有灵芝三萜的特征吸收峰。根据规律可得到在灵芝三萜化合物中C11位没有羰基，在Δ^7（8）Δ^9（11）位存在共轭双键，其吸收强度大多在l0gε3.7～4.1之间。

（3）红外光谱扫描分析

由图12可知，在3446cm-1处有一组比较宽的强吸收峰，说明存在分子间氢键O-H伸缩振动；1137cm^-1处有一组强吸收峰，表明该物质分子中含有羟基；在2360cm^-1处的吸收峰表明该物质中含有羧基；在1647cm^-1处有较强的吸收峰，则表明该物质中含有α、β-不饱和酮；而在1458cm^-1～1217cm^-1中的1294cm^-1、1398cm^-1处的吸收峰是多氢菲环的特征吸收峰。综合以上分析，推断该流分化合物为含有羟基的四环三萜化合物。
综合以上分析，推断该流分化合物为含有羟基的四环三萜化合物。

三、结论

采用回流提取法提取灵芝发酵粉中的三萜化合物，经单因素试验和Box-Behnken试验设计对该提取工艺进行优化，得到最佳工艺参数为：料液比=1∶30（g/mL）、回流时间为3h，回流温度为85℃。在此条件下提取三萜类化合物的平均得率为0.6760mg/g。

通过硅胶柱层析分级得到1组流分，经高效液相色谱检测，发现该组流分含有2个组分。对纯化后的灵芝三萜样品进行了红外和紫外结构分析，确定灵芝发酵粉中其中一流分为含有羟基的四环三萜化合物，在Δ^7（8）Δ^9（11）位存在有共轭双键。通过对灵芝三萜化合物提取和结构初步鉴定，不仅为产品质量检验提供的理论基础，可以更好的了解其功能性。

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