高效降解牛奶过敏原蛋白酶菌种筛选及其重组植物过氧化氢酶的功能验证（一）

发布时间：2021-10-11 13:45 编辑者：特邀作者周世红

人乳的蛋白质质量浓度与动物源乳制品有较大差异(见表1)，这使得免疫系统容易将非人源的蛋白质判定为过敏原因子，并引起一系列超敏反应。酪蛋白作为牛乳蛋白质的主要成分大约占总蛋白质质量分数的80％，其中许多组分并不存在于母乳之中，如α_s1酪蛋白、α_s2酪蛋白和γ酪蛋白，这些组分很难被人体内蛋白酶消化水解，并可能以完整的结构进入人体血液中引起过敏反应。目前普遍认为αs1酪蛋白是主要的过敏原，从表1也可以看出，α_s1酪蛋白是人乳和牛乳中差别最大的蛋白质。

α_s1酪蛋白作为过敏原极难被降解的原因在于乳制品中酪蛋白相互之问极易形成酪蛋白胶粒，一般南α_s1酪蛋白、α_s2酪蛋白、β酪蛋白和κ酪蛋白组成，这些多为分散的、大的、近似球形的胶体粒子，直径一般在50～600nm之间。有研究表明，酪蛋白胶粒中β酪蛋白和κ(酪蛋白可形成大量分子问二硫键，而巴氏灭菌的高温可使得这些二硫键更为复杂，这使得胶粒更难被蛋白酶降解。

一般破坏二硫键需要合适的碱性环境和二硫还原酶或与二硫还原酶功能相似的化学还原剂。二硫还原酶包括烷基过氧化氢还原酶、硫氧还原蛋白还原酶川和二氢硫辛酸脱氢酶等；化学还原剂包括口β-巯基乙醇、巯乙酸和二硫苏糖醇等。此外在生物水解中，许多角蛋白分解菌可生成亚硫酸盐破坏角蛋白酶中的二硫键，从而辅助水解过程的进行。

过氧化氢酶主要存在于细胞及组织内的过氧化体中，参与许多重要反应，是生物体维持稳态的关键酶，也被广泛应用于食品工业，如维持还原环境防止食物被氧化。枯草芽孢杆菌中的植物过氧化氢酶是为数不多的胞外分泌型过氧化氢还原酶，可以催化过氧化氢分解成氧和水。David等的研究表明，其主要功能为协助细胞及细胞分泌的胞外酶对抗环境中的氧化应激。本研究中结合ELISA和质谱鉴定，比对两株种属相同的野生菌发酵液酶活，以及胞外酶的差异，发现了枯草芽孢杆菌植物过氧化氢酶除已报道功能外，还具有破坏酪蛋白胶粒的二硫键，协助蛋白酶高效水解过敏原α_s1酪蛋白。此外，我们还将过氧化氢酶与蛋白酶混合水解脱脂奶粉，使用HPLC和LC-MS/MS分析了水解产物的口感和所生成的功能性多肽，为未来使用混合酶制剂制备脱敏奶制品提供一定理论指导。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种与载体

E.coliDH5α和E.coliBL21(DE3)感受态细胞：生工生物工程(上海)股份有限公司产品；枯草芽孢杆菌S7(菌种保藏编号CCTCCN0.M2016532)：中国典型培养物保藏中心；原核表达载体pET-24a(+)：Novagen公司产品。

1.1.2 主要试剂

细菌小量质粒提取试剂盒、细菌基因组提取试剂盒、卡那霉素和TaqDNA聚合酶：生工生物工程(上海)股份有限公司产品；PrimerSTARDNA聚合酶、SYBRPremixExTaqKit和DNA连接酶：大连宝生物工程有限公司产品；Humancaseinalphas1(CSNlSl)ELISA试剂盒：武汉华美生物工程有限公司产品；NuPAGEBis-Tris蛋白质预制胶和脱脂奶粉：赛默飞世尔科技(中国)有限公司产品；其余试剂均为分析纯。

1.1.3 仪器与设备

高通量全自动菌种筛选及蛋白质结晶工作站(移液工作站)：瑞士帝肯公司产品：MALDI-TOF/T0F基质辅助激光解析电离串联飞行时问质谱仪：美国布鲁克·道尔顿公司产品；游离氨基酸分析专用高效液相色谱仪：美国安捷伦科技有限公司产品；QExactivePlus混合四极轨道质谱仪：美国赛默飞世尔科技有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 目标菌的高通量筛选

将从奶牛牧场收集到的土样处理后，初步获得3000株野生菌，使用高通量全自动菌种筛选工作站将野生菌转移至筛选平板(200g/L马铃薯煮烂后经6层纱布过滤获得的滤过液，20g/L葡萄糖，15g/L脱脂奶粉，15g/L琼脂粉)，挑选产生水解圈的野生菌划线转移至新的平板(见图1)。

1.2.2 针对底物αs1酪蛋白选择性的ELISA分析

将各野生菌编号并转移至PDA液体培养基(200g/L马铃薯煮烂后经6层纱布过滤获得的滤过液，20g/L葡萄糖)中，30℃恒温培养至指数生长期，取发酵液上清液测定酶活进行复筛鉴定。先通过0PA法测定针对脱脂奶粉的酶活，再逐步稀释各个野生菌发酵液上清液，使其针对脱脂奶粉的酶活达到同一水平，以减少发酵液复杂成分带来的影响，此后继续以脱脂奶粉作为底物重复相同的水解过程，但使用针对α_s1酪蛋白的ELISA试剂盒检测各个发酵液上清液对于特定过敏原的酶活，以确定各个野生菌对于过敏原的选择性高低。