高效液相色谱法-硝基苯钾酸位置异构体的分离与对硝基苯钾酸纯度的测定

1、实验目的

(1)了解流动相中pH值变化对分离组分的影响。

(2)熟练掌握工作曲线法定量法，同时了解其他定量方法。

(3)了解HPLC在分析化工产品方面的应用。

2、实验原理

对硝基甲苯酸(p-NBA)是很重要的药物合成中间体，如将p-NBA还原，可产生对氨基苯甲酸。p-NBA的纯度对产品的产率影响很大，一般要求p-NBA的纯度要在99.5％以上。然而，p-NBA中总是含有少量(约0.5％)的异构体杂质邻硝基苯甲酸(o-NBA)和间硝基苯甲酸(m—NBA)。因此，要准确定量p-NBA，首先要将这几种异构体分离。

本实验采用反相HPLC分离这3种异构体，分离的原理是基于异构体之间极性的微弱差异，在甲醇(或异丙醇)和水中的溶解度有微小的不同(分配系数不同)，因而有可能实现三者的分离。

NBA是有机酸，在水中可部分离解成酸根阴离子，使之在流动相中的分配系数变得很大，在反相键合固定相C₁₈中的保留变小，异构体相互之间可能完全不能分离。因此，在流动相中需加入有机酸以抑制NBA的解离，这是实现分离的关键。本实验在流动相中加入醋酸就是这个目的。各种异构体可通过与标准样品的保留时间对照进行定性，采用工作曲线法定量。

3、仪器与试剂

仪器：高效液相色谱仪、紫外检测器、流动相脱气装置。

试剂：o-NBA，m-NBA，p-NBA：分析纯；

p-NBA：市售工业品；

异丙醇、乙醇：分析纯；

醋酸：分析纯；

水：重蒸去离子水。

4、实验内容与步骤

(1)按仪器操作说明开机，使仪器处于工作状态。

(2)设置色谱参数：Micropak C₁₈色谱柱(Ø4.6mm×150mm，5μm)；流动相 (A)为异丙醇：水=20：80(体积比)；流动相(B)为异丙醇：水：醋酸=20： 80：0.4(体积比)，pH值约为2～3；流速1.2mL/min；色谱柱温度为30℃；紫外检测波长为254nm。

(3)配置样品：分别配置约1000mg/L的o-NBA，m-NBA，p-NBA的乙醇溶液；配置o-NBA，m-NBA，p-NBA混合物标样(以质量浓度计)；配置工业品p-NBA的乙醇溶液(约500mg/L)；配置p-NBA标准系列浓度溶液(50～1000mg/L)。

(4)先用流动相(A)，待基线稳定后，通过六通阀注入混合标样，当样品中所有色谱峰出完后，即可停止分析。

(5)改用流动相(B)，再次注入混合标样。比较两种流动相的分离效果。

(6)在最佳分离条件下分别注入o-NBA，m-NBA和p-NBA标样，用保留时间对混合物中3种异构体进行定性并记录峰面积。

(7)利用标准p-NBA系列浓度溶液，作浓度一峰面积工作曲线。

(8)注入已配置的混合标样，重复3次(峰面积误差小于3％)，取平均值计算校正因子。

(9)注入市售工业品p-NBA样品溶液，重复3次(峰面积误差小于3％)，取平均值。

5、注意事项

(1)按实验室提供的仪器操作规程操作仪器。

(2)流动相中pH值可按实际分离情况进行调节。

6、数据处理

(1)将流动相中含醋酸与不含醋酸时各异构体的保留时间、峰高或峰面积整理成表，比较两种情况下的分离效果(以分离度表示)，并简述原因。

(2)用3种方法计算市售工业品p-NBA的纯度(分别用工作曲线法、外标法和归一法计算)。

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